Analysis of selected symbiosis repressed poplar genes upon ectomycorrhiza formation

Abstract

Damit eine Symbiose zwischen Ektomykorrhizen und Pflanzen stattfinden kann, muss die Struktur und Funktionalität von Feinwurzeln angepasst werden. Nur so kann der Stoffaustausch von Zucker gegen Nährstoffe und weitere Metabolite stattfinden. Die grundlegenden Prozesse dieser Anpassungen sind dabei in großen Teilen noch unerforscht. Auf dieser Grundlage wurden in vorangegangenen Studien durch genomweite Genexpressionsanalysen drei Pappel Gene identifiziert, deren Transkription in Mykorrhizen 20 – 100 -fach niedriger war. Es handelte sich dabei um ein Kalzium Bindeprotein (Potri.2G2183), einen Aminosäure Transporter (Potri.2G0797) und ein Enzym aus dem Fettstoffwechsel (Potri.9G1040). Um die Proteine zu charakterisieren und den Mechanismus der Regulierung herauszufinden, wurden die Promotoren in dieser Arbeit auf mögliche cis-Elemente untersucht. Dafür wurden Promotor-Reporter Konstrukte mit Fluoreszenzproteinen hergestellt und dann mittels Agrobakterien zur Behandlung von Komposit Pappeln verwendet. Als Grundlage für diese Analyse konnte im Rahmen dieser Arbeit durch einen Wechsel von pPLV zum pCXUN basierten Vektorrückrat die Transformationseffizienz der Pappeln um 69.8% erhöht werden. Weiterhin wurde herausgefunden, dass weder die Orientierung der Fluoreszenz Kassetten auf der T – DNA, noch deren Größe einen messbaren Einfluss auf die Pflanzentransformationseffizienz haben. Dabei konnten Promoter Bereiche von Potri.2G2183 und Potri.2G0797 erfolgreich mittels PCR amplifiziert und trunkiert werden. Zur weiteren Charakterisierung der Promotoren, wurden diese und ihre Trunkierungen in eine eGFP-NLS Expressionskassette kloniert. Um potenzielle cis – Elemente durch Auswertung visueller Daten zu finden, wurde eine konstitutiv exprimierende tdTomato-NLS Expressionskassette in Tandem mit der Promoter Kassette geschaltet (Grün: Rot Verhältnis). Diese Verhältnisse können gegebenenfalls Aufschluss über Änderungen in der Genexpression durch die Mykorrhizierungen geben. Als Alternative zu diesen so genannten Doppelmarker Konstrukten aus eGFP und tdTomato wurde das Timer Protein DsRED-E5 etabliert. Weil das grüne Signal im Verhältnis zum roten Signal im Falle des Timer Proteins sehr schwach war, wurde die Bildaufnahme durch Variierung des der Kameraeinstellungen optimiert. In anschließenden Studien muss diese Methode nun auf Anwendbarkeit in Mykorrhizen getestet werden. Insgesamt muss die visuelle Quantifizierung noch weiter optimiert werden. Auch subzälluläre Lokalisierung der Gene basierend auf transienter Expression in Tabakblättern wurde durchgeführt. Da hier keine eindeutigen Signale detektiert werden konnten, muss das System weiter angepasst und optimiert werden.