Modulation of the cellular content of adenosine triphosphate in cultured primary brain astrocytes

Abstract

Astrozyten sind ein wichtiger Bestandteil des Gehirns. Sie werden oft als glykolytische Zellen beschrieben, da sie große Mengen an Glukose durch Glykolyse verstoffwechseln. Pyruvat, welches das Endprodukt der Glykolyse darstellt, wird als Substrat für den mitochondrialen Tricarbonsäurezyklus sowie die darauffolgende oxidative Phosphorylierung verwendet. Sowohl die zytosolische Glykolyse als auch die mitochondriale oxidative Phosphorylierung sind essentiell für die Regenerierung von Adenosintriphosphat (ATP), dem universellen Energieträger aller Zellen. Um das Potenzial endogener und exogener Substrate zur Regenerierung und Aufrechterhaltung eines hohen ATP-Gehalts zu ermitteln, wurde anhand von Astrozytenkulturen untersucht welche Stoffwechselprozesse an der Regenerierung von ATP beteiligt sind.

Der durchschnittliche spezifische zelluläre ATP-Gehalt von Astrozytenkulturen beträgt ungefähr 30 nmol/mg und konnte durch einen Entzug von Glukose verringert werden. Nach Glukoseentzug waren Astrozyten in der Lage, den initialen hohen ATP-Gehalt für bis zu 6 Stunden aufrechtzuerhalten, während der ATP-Gehalt nach 24 Stunden auf 30% gesunken war. Dies deutet darauf hin, dass endogene Energiespeicher für die Regenerierung von ATP mobilisiert werden. Astrozyten, die 1 mM Glukose zur Verfügung hatten, waren in der Lage, ihren spezifischen zellulären ATP-Gehalt über einen Zeitraum von 24 Stunden aufrechtzuerhalten und Astrozyten die 5 mM Glukose zur Verfügung stehen hatten, konnten den ATP-Gehalt bis zu 72 Stunden aufrechterhalten. Neben Glukose waren noch weitere exogene Substrate in der Lage den ATP-Gehalt über einen Zeitraum von 24 Stunden aufrechtzuerhalten, diese Substrate waren Monosaccharide (Fructose, Mannose), Monocarboxylate (Laktat, Pyruvat, Acetat), Aminosäuren (Alanin, Aspartat, Glutamat, Glutamin, Lysin oder Prolin), Ketonkörper (β-Hydroxybutyrat), Fettsäuren (Decanoat, Octanoat oder Palmitat) und Nukleoside (Adenosin, AMP, ADP, Inosin oder Guanosin). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass alle drei getesteten Fettsäuren sowie die Aminosäure

Prolin bezogen auf ihren jeweiligen Kohlenstoffgehalt wirksamere Energielieferanten darstellen als Glukose. Astrozyten sind somit in der Lage, verschiedene exogene Subtraten für die Regeneration von ATP zu verwerten.

Verschiedene Inhibitoren wurden verwendet, um den Verlust von ATP in glukose-verarmten Astrozyten herbeizuführen. Die Verwendung des Atmungskettenhemmers Antimycin A und des mitochondrialen Entkopplers BAM-15 führte zu einer starken Verringerung des ATP-Gehalts. Eine Co-Inkubation beider Modulatoren in Glukose-gefütterten Astrozyten führte zu einer geringeren Verringerung des ursprünglichen ATP-Gehaltes von 60% (BAM-15) und 40% (Antimycin A) innerhalb von 5 Stunden. Inhibitoren des Pyruvat-Transports (UK5099) und der mitochondrialen Fettsäureaufnahme (Etomoxir) hatten über eine Inkubationszeit von 8 Stunden kaum einen Einfluss auf den ATP-Gehalt von Glukose-verarmten Astrozyten, während eine Co-Inkubation von UK5099 und Etomoxir zu einer vollständigen Verarmung an ATP innerhalb von 5 Stunden führte. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Bedeutung des mitochondrialen Stoffwechsels für die Regeneration von ATP in Astrozytenkulturen.

Des Weiteren wurde die Hemmung der Glykolyse durch 2-Desoxyglucose (2DG) untersucht. Die Zugabe von 10 mM 2DG führte zu einer schnellen Akkumulation von 2-Desoxyglucose-6-phosphat (2DG6P) und einem schnellen aber nicht kompletten Abfall des ATP-Gehaltes. Eine Co-Inhibierung der Glykolyse durch 2DG sowie die Hemmung der mitochondrialen Atmung führte zu einem beschleunigten Verlust von ATP und unterstreicht die Wichtigkeit eines funktionierenden Zusammenspiels beider Stoffwechselwege.

Die in dieser Thesis vorgestellten Daten verdeutlichen die starke Beteiligung der Glykolyse und des mitochondrialen Stoffwechsels an der Regeneration und Aufrechterhaltung von ATP in Astrozyten und zeigen das endogene und exogene Substrate verwendet werden können um einen hohen ATP-Gehalt in glukoseverarmten Astrozyten zu erhalten.