Optimized encapsulation substances and feeding regimes for administering an oral vaccine in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum)

Abstract

Impfungen bei Tieren sowie bei Menschen sind eine der wertvollsten Errungenschaften der Menschheit, um krankheitsbedingte Herausforderungen einer sich intensiv verändernden Umwelt zu bewältigen. Während Impfstrategien mit Injektions-Impfstoffen für terrestrische domestizierte Tierarten gegenwärtig effektiv entwickelt sind, ist die Impfung von Tierarten in der Aquakultur weltweit bisher keine gängige Praxis. Aufgrund des hohen Arbeitsaufwandes sowie technologischem und finanziellem Aufwand finden injektive Impfungen in der Aquakultur in Entwicklungs- und Schwellenländern kaum Anwendung. Die Anwendung von Oralvakzinen bietet demnach als Alternative zu injektiven Impfungen viele Chancen. Sie können anwendungsbezogenen Probleme bewältigen und dem Tierwohl, der Umwelt, wie auch der Produktionseffizienz zu Gute kommen. Um eine effektive Oralvakzine entwickeln zu können, sind jedoch noch Hürden zu bewältigen, wie die Frage nach der gezielten, oralen Verabreichung und des wirksamen Schutzes vor der Zerstörung der aktiven Vakzine durch das Systemwasser oder durch enzymatische sowie chemische Degeneration. Die drei Kapitel dieser Dissertation beschäftigen sich mit der Optimierung des Fütterungsregimes, sowie mit der Evaluierung unterschiedlicher Impfstoffträger- / Verkapselungssubstanzen am Beispiel der Zieltierart Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss). Die Ergebnisse dieser Arbeit ermöglichen nicht nur eine kontrollierte und sichere Verabreichung einer Oralvakzine, sondern sind für das Hervorbringen einer effektiven Herdenimmunität nach oraler Impfung unabdingbar. In Kapitel 1 wurden die Auswirkungen verschiedener Fütterungsregimes auf das individuelle Fressverhalten von juvenilen, in einer Kreislaufanlage (RAS) kultivierten Regenbogenforellen untersucht. Die veränderten Parameter des Fütterungsregimes umfassten Ausnüchterungsperioden, die Anzahl der täglichen Fütterungen und die Anzahl der Futterzugaben pro Fütterung. Diese zeigten einen signifikanten Einfluss auf die Homogenität und Gesamtmenge der Futteraufnahme. Um das Fressverhalten während der verschiedenen Fütterungsszenarien zu bewerten, wurde die minimale Pelletaufnahme (MPI) als Maß für eine garantierte Pelletaufnahme pro Individuum etabliert. Dabei beschreibt die MPI den Anteil an gefütterten Fischen, der eine Mindestanzahl an Pellets gefressen hat. Im Hinblick auf die Anwendung als Schluckimpfung kann die MPI für die Impfstoffquantifizierung eines Impfpellets verwendet werden. Die Ergebnisse des Ausnüchterungsversuches zeigten, dass die Fresshomogenität bei unveränderter aufgenommener Futtermenge erhöht werden kann, wenn die Tiere keinerlei Ausnüchterungsperiode erfahren. Die Anzahl der täglichen Fütterungen kann genutzt werden, um die Gesamtmenge des aufgenommenen Testfutters bei gleichbleibender Futterhomogenität zu erhöhen. Je nachdem, wie viel Impfstoff bzw. wie viele Pellets pro Fisch intendiert sind, kann die Anzahl der täglichen Fütterungen (ein- oder zweimalige Fütterung pro Tag) die MPI erhöhen, ohne dass dies zulasten der Aufnahmehomogenität geht. Eine zusätzliche dritte Fütterung führte indes zu einer deutlichen Verringerung der Aufnahmehomogenität und wird demzufolge bei der Anwendung einer Schluckimpfung nicht empfohlen. Vorteilhaft für die MPI und die Aufnahmehomogenität ist die Verwendung mehrerer Portionen während eines Fütterungsereignisses. Hier zeigte die Aufteilung auf drei und fünf Portionen pro Fütterung einen deutlichen Vorteil gegenüber nur einer Futterzugabe bei gleicher Gesamtmenge. Insgesamt kann die Optimierung des artspezifischen Fütterungsregimes dazu genutzt werden, die Pelletaufnahme und -homogenität zu erhöhen und eine minimale Pelletaufnahme pro Fisch zu garantieren. In Kapitel 2 wird die Forschungsfrage untersucht, inwiefern die Substanzen Alginat und Polyethylenglykol (PEG) geeignet sind, um die aktiven Impfstoffkomponenten während der Fütterung vor der Loslösung in das Systemwasser und später vor dem enzymatischen und chemischen Abbau im Fischdarmtrakt zu schützen. Um eine potenziell schädliche Wirkung von Alginat und PEG auf den Verdauungstrakt von Jungforellen auszuschließen, wurden die Testsubstanzen, eingebettet in ein kommerzielles Futter, 22 Tage lang kontinuierlich gefüttert und verschiedene Darmabschnitte der Versuchstiere histomorphologisch ausgewertet. Zudem wurden die Genexpression der proinflammatorischen Gene TNF-α, IL-1β und IL-8 untersucht, um eine eventuell auftretende systemische Entzündung auszuschließen. Die Fütterung beider Substanzen über den festgelegten Testzeitraum führte zu keiner signifikanten intestinalen Beeinträchtigung oder entzündlichen Genreaktion. Die Beimengung von PEG zum Fischfutter führte mitunter zu signifikanten Veränderungen des Darmgewebes, zu vermindertem Wachstum und zu einem leicht erhöhten Milzgewicht. Beide Substanzen wurden für die Verwendung bei Oralvakzinationen bei einmaliger bzw. bei einer Booster-Immunisierung als unbedenklich eingestuft. In Kapitel 3 wurden die drei Verkapselungssubstanzen Alginat, PEG, Chitosan sowie ein zusätzliches hydrophobes Öl-Coating auf ihre biophysikalischen Fähigkeiten untersucht, wie sie jeweils ein verkapseltes Modellprotein unter unterschiedlichen pH-Milieus freigeben. Darüber hinaus wurden in situ die Verdauungsgeschwindigkeiten der Testsubstanzen in Verbindung mit einem mit Eisenpuder verabreichten Futtermittel anhand von Röntgenaufnahmen evaluiert. Die Verkapselungsversuche zeigten, dass insbesondere die Verwendung von Alginat mit Chitosan eine ideale Verkapselung und ein optimales Freigabeprofil bei einer modellierten Fütterung darstellten. In der Regel führt das Einbringen der Kapsel in das Systemwasser zu einer starken initialen Freigabe des Modellproteins in das Systemwasser. Dieser „initiale Burst“ kann jedoch durch die Verwendung eines hydrophoben Öl-Coatings stark reduziert werden. Die Beigabe von PEG ermöglicht es, höhere Freigaberaten zu erzielen, jedoch leidet gleichzeitig der Verkapselungsschutz. Die Verwendung einer Alginat-Chitosan-Verkapselung bietet bei einer Schluckimpfung einen signifikanten Schutz gegen Zerstörung durch das Systemwasser und vorzeitige Degeneration im Fischverdauungstrakt. Bei der Evaluierung der Verdauungsgeschwindigkeiten konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Behandlungen festgestellt werden. Es zeigte sich, dass alle Testfuttermittel den Enddarm nach 16 h erreicht haben und weitere Anpassungen der Verkapselung sollten auf eine maximale Impfstofffreigabe 16 h nach Verabreichung abzielen. Die Ergebnisse erlauben eine gezielte Optimierung der Verkapselungsmatrix beim Schutz der bioaktiven Substanz und der Freigabe am Zielort (Fisch-Enddarm). Die neuen Erkenntnisse dieser Dissertation tragen zur Lösung aktueller Probleme bei der Entwicklung eines oralen Impfstoffs für die Aquakultur durch die Optimierung der Fütterungsregime und Vakzine-Trägersubstanzen bei. Sie bilden hierbei nicht nur die Grundlage für die optimale Verabreichung und Verkapselung eines oralen Impfstoffes, der für einen effektiven Impfschutz unerlässlich ist, sondern auch für die Verabreichung anderer hochwertiger bioaktiver Substanzen, für die eine definierte Verabreichung von zentraler Bedeutung ist.