Nanofibrous fibrinogen scaffolds : Towards an understanding of the selfassembly mechanisms and an application as a biomaterial

Abstract

Das Plasmaprotein Fibrinogen ist ein entscheidendes Protein bei der Blutstillung und Wundheilung. Bei Gefäßverletzungen wird Fibrinogen enzymatisch in unlösliche FibrinNanofasern umgewandelt. Nach einer Verletzung spaltet das Enzym Thrombin vom löslichen Fibrinogen zwei kleine Fibrinopeptide ab, wodurch Bindungsstellen freigelegt werden, die die Polymerisation zu Fibrin-Nanofasern ermöglichen, die ein Blutgerinnsel bilden, welches die Wunde verschließt. Aufgrund seiner in vivo-Funktionen als Blutgerinnsel und als provisorische extrazelluläre Matrix ist Fibrinogen ein vielversprechender Kandidat für die Herstellung neuartiger Biomaterialien zur Wundbehandlung. Die Hauptidee der aktuellen Forschung besteht darin, aus Fibrinogen Nanofasern zu gewinnen, die eine ähnliche Morphologie und ähnliche Eigenschaften wie Fibrin-Nanofasern aufweisen, die jedoch in vitro ohne die enzymatische Spaltung durch Thrombin hergestellt werden. Eine Haupttechnik zur Gewinnung von Nanofasern aus biologischen Materialien ist das Elektrospinnen, das jedoch insbesondere für die Herstellung von Proteinfasern einige Nachteile hat. Wegen dieser Nachteile sind einige Methoden beschrieben worden, bei denen die Selbstorganisation von Fibrinogen zu Nanofasern genutzt wird, zum Beispiel in speziellen Puffern oder auf hydrophoben Oberflächen. Die Selbstorganisation von Fibrinogen zu Nanofasern, die auch ohne enzymatische Aktivierung stattfindet, ist ein interessantes und noch nicht vollständig verstandenes Phänomen. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit die Selbstorganisation von Fibrinogen untersucht, indem Fibrinogen in Gegenwart verschiedener Ionen getrocknet wurde. Es konnte gezeigt werden, dass in der Anwesenheit von Ionen Fibrinogenfasern entstehen, die während des Trocknungsprozesses gebildet werden, wenn Fibrinogenkonzentrationen im physiologisch relevanten Bereich von 2 bis 5 mg/ml genutzt werden. Die Selbstorganisation von Fibrinogen wurde in Gegenwart verschiedener Ionen und bei pH-Werten von 7 bis 9 beobachtet. Interessanterweise war die analysierte Selbstorganisation ein oberflächenunabhängiger Prozess, und die Trocknung von Fibrinogen führte zu faserigen Gerüsten auf hydrophilem Glas und Gold sowie auf verschiedenen hydrophoben Polymeren. Da die durch Self-Assembly hergestellten Fibrinogen-Fasergerüste Abmessungen bis zu mehreren cm2 erreichten und vergleichsweise niedrige Fibrinogenkonzentrationen benötigten, wurde eine neue Methode zur Herstellung von Fibrinogengerüsten durch Selbstorganisation entwickelt. Die Selbstorganisation während des Trocknens in Gegenwart von Ionen war jedoch ein reversibler Prozess, und die präparierten Fibrinogenfasern waren bei der Rehydratation nicht stabil, was ein Problem für weitere Experimente oder eine potentielle zukünftige Anwendung darstellt. Daher wurden verschiedene chemische Quervernetzungsverfahren auf ihr Potenzial zur Stabilisierung der Fibrinogengerüste analysiert. Es zeigte sich, dass die Behandlung mit Formaldehyd- oder Glutaraldehyddampf zu einer zuverlässigen Vernetzung des Fibrinogen-Gerüsts führte und die Faserstruktur erhalten blieb. Im zweiten experimentellen Hauptteil dieser Arbeit wurden Veränderungen der Sekundärstruktur während der Fibrinogen-Selbstorganisation mittels Zirkulardichroismus analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Bildung von Fibrinogenfasern mit einem Übergang von α-helikalen in β-Faltblattstrukturen einhergeht. Der native Gehalt von 23 % α-helikal und 28 % β-Blattstrukturen wurde zu 19 % bzw. 32 % verschoben. Bemerkenswert ist, dass die Veränderung der Sekundärstruktur reversibel war, wenn vernetzte Fasern rehydriert wurden. Eine zusätzliche Thioflavin T-Färbung zeigte, dass die beobachtete Veränderung der Sekundärstruktur nicht auf die Bildung von βAmyloidstrukturen zurückzuführen war. Da das Verständnis der Fibrinogen-Selbstorganisation die Herstellung von Fibrinogengerüsten ermöglicht, die in Zukunft als Biomaterial für Tissue Engineering und Wundheilungsanwendungen eingesetzt werden könnten, wurde im dritten Hauptteil dieser Arbeit die Bioaktivität von selbstorganisierten Gerüsten untersucht. In Experimenten, die über 35 Tage durchgeführt wurden, konnte gezeigt werden, dass der Langzeitabbau von Fibrinogen-Gerüsten von der Vernetzungszeit in Formaldehyddampf abhängig ist. Darüber hinaus zeigten die Langzeitinkubationen, dass einzelne Enzyme wie Plasmin oder Thrombin keinen zusätzlichen Einfluss auf die Stabilität des Fibrinogen-Gerüstes hatten, während eine Kombination von Plasmin und Urokinase zu einem beschleunigten Abbau führte. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben einen Einblick in den Mechanismus der Fibrinogen Faserbildung, der scheinbar auf dem Ausschluss von Wasser während des Trocknungsprozesses und auf dem dem Effekt von Ionen auf die Hydratationshülle des Fibrinogenmoleküls beruht. Insgesamt kann die Fibrinogen-Selbstorganisation auf vielen Oberflächenmaterialien verwendet werden, erfordert eine niedrige Fibrinogenkonzentration und kann bei physiologischem pH-Wert durchgeführt werden, was die FibrinogenSelbstorganisation zu einer potenziellen Alternative zu anderen Herstellungstechniken für Fibrinogen-Biomaterialien macht. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse der Sekundärstrukturanalyse und der Bioaktivitätsuntersuchung darauf hin, dass das Fibrinogen während der Selbstorganisation intakt und biologisch aktiv blieb. Daher verfügen Fibrinogengerüste, die mit dem neu entwickelten Verfahren der salzinduzierten Selbstorganisation hergestellt wurden, über ein großes Potential für zellbiologische Untersuchungen oder sogar zukünftige Anwendungen in der Wundheilung.